James Best 1950-ben kezdett el filmekben szerepelni, a Zendülés a Caine hadihajón című alkotásban például Humphrey Bogart oldalán játszott. Később olyan sorozatokban is feltűnt pár epizódban, mint a The Andy Griffith Show, az Alfred Hitchcock bemutatja című antológia vagy a Gunsmoke című western.
Legismertebb szerepe a Hazárd megye lordjai Rosco seriffje volt, akinek a sorozatból készült rajzfilmben, a The Dukes-ban a hangját is kölcsönözte, a karaktert pedig többek között az 1997-es tévéfilmben, a Hazárd megye lordjai: A visszatérés-ben is újra megjelenítette. Itt intézkedés közben láthatjuk, az oldalán Bunkó fönőkkel:
A kétezres években már viszonylag kevés szerepet vállalt, inkább színészmesterséget tanított különféle egyetemeken. Emellett saját produkciós céget vezetett, és festőként is elismertté vált, önéletrajzi könyve, a Best In Hollywood: The Good, The Bad and The Beautiful 2009-ben jelent meg.
Halálhíre saját honlapján jelent meg először, a híradás szerint tüdőgyulladása szövődményeibe halt bele 88 évesen.